千亿国际棋牌下载

当前位置: 首页- 公司简介 DNA966常见问题分析与解释 
DNA966常见问题分析与解释
1、DNA966样品用什么溶液溶解比较好?
  答:溶解DNA966样品时,用灭菌蒸馏水溶解最好。DNA的966反应也是Taq酶的聚合反应,需要一个最佳的 酶反应条件.如果DNA用缓冲液溶解后,在进行了966反应时,DNA溶液中的缓冲液组份会影响966反应的体系条件,造成Taq酶的聚合性能下降。
  有很多客户在溶解DNA966样品时使用TE Buffer。的确,TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性,但TE Buffer对DNA966反应有影响,根据我们的经验,我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA966样品。

2、提供DNA966样品时,提供何种形态的比较好?
  答:我们推荐客户提供菌体,由我们来提取质粒,这样DNA样品比较稳定。
  如果您要以提供DNA样品,我们也很欢迎,但一定要注意样品纯度和数量。 提供的966样品为PCR产物时,特别需要注意DNA的纯度和数量。PCR产物应该进行切胶回收,否则无法得到良好的966。有关DNA966样品的详细情况请严格参照“966模板的要求”部分的说明。

3、提供的966样品为菌体时,以什么形态提供为好?
  答:一般菌体的形态有:平板培养菌、穿刺培养菌,甘油保存菌或新鲜菌液等。我们提倡寄送穿刺培养菌 或新鲜菌液。平板培养菌运送特别不方便,我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎,面目全非,需要用户重新寄样。这样既误时间,又浪费客户的样品。一 旦是客户非常重要的样品时,其后果更不可设想。而甘油保存菌则容易污染。
  制作穿刺菌时,可在1.5ml的Tube管中加入琼脂培养基,把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基(固体)中,37℃培养一个晚上后便可使用。穿刺培养菌在4℃下可保存数个月,并且不容易污染,便于运送。

4、与966app有关的问题:
  答:对于通用966app,只要正确使用,一般不会有太大问题,966app问题主要发生在客户自己提供的PCRapp上。应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的app都可以用来作966,以下几种PCRapp将是不适合用作966app的:
(1)简并app
  简并app必然要在966模板上有多个结合位点,直接影响966结果。
(2)随机app,如RAPDapp
  随机app一般都比较短,所用退火温度低,在966反应的条件下,不能很好地与模板结合。
(3)过长的app,一般要求966app不大于24bp,最长不能超过30bp
  过长的app在966反应的较低的条件下容易在966模板上有多个结合位点,导致966结果背景较长的app纯度也将难以保证。通常用于966的app纯度要在90%以上,app纯度低时,966反应的背景将明显增大,直接影响到966结果。
(4)有特殊标记的app
  该情况主要指荧光标记的app。我们966反应的四种碱基都是荧光标记的,这样,荧光标记的app将产生干扰。另外,其他一些有大的标记基团的app也最好不要用于966。app上大的标记基团将直接影响到DNA片段的迁移率,导致966结果峰型不好或错误。
(5)不纯的app
  966app对纯度的要求很高,合成的app中非全长的片段可以造成较强的背景。以一个20bp的966app为例,直接脱盐纯化的话,纯度至多在70%左右,也就是说将有30%的app将作为背景噪音,这必将严重影响966结果。 一般经PAGE或OPC法纯化的app基本能达到966的要求。
5、怎样选择(设计)966用app?
  答:966用app要求非常严格,不同于PCR用app。PCR用app一般只要能和模板结合,3’端的几个碱基能完全配对,即使app长达80~100多个碱基,只要调整PCR反应条件,也能成功进行PCR反应。 而966用app便不一样了,必须严格符合以下要求。本公司的966用app全用app设计软件Primer设计。在本公司966时,我们可免费帮助设计966用app。  
  (1)长度在15~25个碱基左右,一般选择20个碱基(根据GC含量作适当调整),
  (2)3’端尽量选择G或C碱基(但不绝对),以增加与模板的结合能力。
  (3)Tm温度应选择50℃~70℃左右。
  (4)GC含量应选择在50%左右,尽量避开A、T、G、C的连续结构。
  (5)避开app自身形成发夹结构或app二聚体结构等复杂结构。
  (6)保证app和模板100%匹配,特别是3’端的几个碱基一定要100%匹配。同时必须严格保证app和模板之间只能有一个结合位点。

6、PCR片段直接966和PCR片段经克隆后966的结果有何区别?
  答:众所周知,PCR圹增过程中会出现很多错配现象,但不可能所有的错配都发生在同一位置。PCR片段直接966时,其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果。如果在某一个点上出现了几十次错配现象,但大多数分子(或许是几十万个分子)在这个点上应该还是正确的,在966时,错配现象也就是反映不出来了。因此,PCR片段直接966的结果反映的是PCR用模板最原始的结果。而PCR片段经克隆后966是测定了某一个分子的DNA序列。在几十个循环的PCR扩增过程中,很难保证某一个分子的任何点都不发生错配。因此,PCR片段经克隆后的966结果,往往存在着一些错配的序列,和PCR片段直接966的结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。要减少PCR扩增过程中的错配现象,在PCR反应时,请选用保真性能高的DNA聚合酶。

7、966结果不到800Bases,还照常收费了,为什么?
  答:如在DNA样品中的DNA序列分布匀称,没有复杂结构时,正常的966反应能保证达到800Bases以上。但有一些DNA样品立体结构复杂,造成聚合酶延伸反应终止,966信号突然减弱或消失,或者966结果出现套峰现象,出现这些现象的原因由DNA模板本身所造成(公司保证进行2次以上的966工作)。
在于聚合酶进行聚合反应时,由于A或T的连续,聚合酶难以识别完整的每个A或T,在某个A或T的后面便开始进行A或T连续结构以后序列的聚合反应(打滑现象),造成966结果紊乱,出现套峰。
  一般在多少个A或T的后面能出现这种情况呢?现在还没有这方面的报道。根据我们的经验,这一情况的出现和A或T的连续结构后面的序列的排列情况有着直接的关系。有时10多个A或T的连续结构后面便出现套峰,但有时60~70个A或T的连续结构后面的序列也一样可以完整地读出来。具体情况还有待考证。
  一般来说,PCR片段直接966时,A或T的连续结构后面的序列966结果都会出现套峰。原因在于966时经历了PCR反应及966反应(966反应本身也是PCR反应)二次聚合酶的打滑现象。
   (3)原因不明的复杂结构,966结果出现突然信号减弱或消失。从序列上看,DNA碱基排列并无特别异常。 估计是DNA整体出现复杂结构,从某一位置开始聚合酶的聚合反应便无法进行。

8、出现套峰的原因是什么?
  答:在966反应中,模板或app的原因都可能造成套峰的形成,归结其形成原因有以下几点:
  (1)966app在模板上有两个结合位点形成套峰;
  (2)模板不纯,如果是质粒或是菌液,原因是非单克隆,如果是PCR,原因为非特异性条带;
  (3)模板序列的特殊结构,如poly结构、发卡结构等;
  (4)app降解,app不纯,或app的特异性不好。

9、我为什么找不到我的PCRapp?
  答:以下几种情况,我们将无法找到做PCR时的app序列
  (1)用PCRapp作为966app进行966时,所966列是从app3’末端后第一个碱基开始的,所以自然就找不到您的app序列了。有两种方法可以得到您的app序列。对于较短的PCR产物(<800bp),可以用另一端的app进行966,从另一端966可以一直测到序列的末端,就可以在序列的末端得到您的app的反向互补序列。对于较长的序列,一个966反应测不到头,因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中,用载体上的通用app进行966。由于载体上的通用app与您的插入序列之间还有一段距离,因此就可以得到您的完整的app序列。由于在966的起始端总会有一些碱基无法准确读出,因此,您如果想得到您的PCR产物的完整序列,最好克隆后进行966。
  (2 PCR产物用T载体克隆后,由于克隆的方向是随机的,因此,当您在一条链上找不到您的app序列时,试图在互补链上寻找您的app序列。
  (3)当966app离您的插入片段很近时,有时可能也无法找到您的app的全序列。这主要是因为有时966的起始端由于未去除的染料或app二聚体的干扰,造成起始区的序列不好,可能无法找到您的app完整序列。
  (4)有时,质粒做模板进行966时,由于某些原因,质粒上没有插入外援片段,为空载列完全为载体序列,此时自然也找不到app序列。
10、我的基因序列与标准序列为什么有差别?
  答:一段基因序列经扩增后,克隆到载体中进行966。在两个层次上可能导致序列发生变化。首先在PCR扩增过程中就可能产生错误。将片段克隆到载体中也有可能发生突变。其次,966的准确率问题。ABI公司承诺其仪器的966精度在一定范围内可以达到98.5%以上。由于仪器准确率的限制,在一个较长的序列中发生碱基序列错误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下,通过双向966可以最大限度减少966的错误。您如果想得到您的最准确的序列,进行双向966是很有必要的。只进行简单的单向966,我们无法保证所966列的完全准确性,这是由仪器的精度决定的。

11、过短的PCR产物为什么不适于直接966?
  答:首先过短的PCR产物纯化困难,一般的PCR产物纯化试剂盒都要求PCR产物片段大于150bp,过短的PCR产物纯化和准确定量都非常困难。因此我们要求用于966的PCR产物一般不低于150bp长度。其次,由于966技术本身的限制,966反应对环境的干扰比较敏感,模板太短干扰更大,很容易造成966失败。

12、用966的方法检测点突变可靠吗?
  答:有的客户想用966的方法检测点突变体,我认为该方法可靠性不高。主要有以下两个原因。首先,我们并不清楚突变的序列与正常的序列的比例是多少。966反应的信号强度直接与模板的量有关,如果突变的模板所占的比例很少,将直接作为背景噪音了,很难检测出来。只有当966反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时,才能较可靠地检测到突变体的存在。其次,在同一位置,不同碱基的信号强度一般是不一样的。这样即使突变的模板所占的比较较高时,也不一定能准确检测到突变的存在。另外,966仪是设计用来966正常的碱基序列的,软件在对扫描的结果进行处理时,会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低,以得到尽可能好的结果。因此,当某处出现双峰时,966仪一般会认为信号弱的峰为背景信号,在处理过程中,将弱的峰进一步压低,这样根部不立于突变体的检测。因此认为,用966的方法检测突变体的存在不是一个好的方法。

13、我要求5’到3’正向966,为什么你们给我的序列是反的?
  答:您指的可能是插入片段的方向,而我们并不清楚您的样品是如何构建的。我们只能根据质粒上的序列来确定966方向,所以在966app一栏中请不要使用3’app和5’app这样的字样,因为我们手中的资料在注明方向时可能和您手中的资料方向相反,请以T7,T3,SP6,M13f,M13r这样的形式来填写,或注明酶切位点方向比如“966方向EcoRI到HindIII”。我们手中等质粒资料有限,有时还需要您提供质粒的相关资料。

14、我的样品在你们所说的可靠范围内有一处存在疑问,能否重新测一次?
  答:我们希望您能够告诉我们存在疑问的位点的位置,如果从966报告上的确无法作出准确判读,我们会重新进行实验。如果您指出的位点信号清晰准确,您仍然要求再进行一次实验,那么实验结果和验证实验是相同的。

15、我的样品送966前已经鉴定过了,有插入片段的,为什么你给我的966结果是一个空质粒?
  答:造成这种现象主要有两个原因。
  (1)鉴定过程中的假阳性。鉴定插入片段主要是通过PCR和酶切两种方式鉴定。由于PCR反应受多种条件的影响,在鉴定过程中易产生假阳性,而酶切鉴定是比较可靠的鉴定方式。
  (2)我们由于条件的限制,无法单独的对某一个客户的样品进行特定条件的培养,所以可能在培养过程中发生插入片段的丢失。由于这种情况的发生无法事先预期到,所以我们也只能对出现这样情况的客户说抱歉。直接提供质粒虽然可以避免这样的情况,但由于质粒制备上的问题,966的成功率可能会受到影响。

16、DNA片段很长,一个反应读不到头,怎么办?
  答:如果DNA片段在载体上,可以用载体上两端的app同时966,让其中间交叉互补,便可完全测通。如果这样还读不通,可在已经测出序列的450~500个碱基处设计966app作进一步966(此称为Primer Walking法),便可完全966。

17、我的样品你们已经测通了,但为什么在overlap区有这么多的错配,给出的全序列和单个报告也称作差异,我该相信谁?
  答:给出的全序列是一个拼接的结果,当互相拼接的两个序列存在差异时,应该以序列质量更好的应该为主,这也就是为什么会出现错配和全序列与单个966结果的差异。

18、你们为什么在primer walking时总将app设计的那么靠前?
  答:我们在设计app时有两个准则。一是设计app区域的序列必须准确,二是在app区后必须还有足够的准确序列以便拼接。这样我们设计app的位置就必然比较靠前,在满足软件设定的条件下,我们总会选取最靠近3’端的app来作为最终的966app。

19、我有一个4KB的PCR片段,希望你们帮我测通。
  答:大于2KB的PCR片段要测通最好是构建好克隆后再进行966。这样模板更加稳定,966效果也更加好一些。

20、966完成后,966样品和app将如何处理(或保存)? 
  答:客户需要将966样品或app(客户自带的)返还时,我们在发送966报告的同时,按客户要求关注样品或app(客户自带的)。对于没关注的966样品和app,公司负责保存1个月(从样品收到之日算起),超过1个月还需966的样品,请客户另行提供。

812cc网站官网威廉希尔登官网平台国际乐虎pt